Banca de QUALIFICAÇÃO: SILVIA CRISTINA DA SILVA PEDROSO

Uma banca de QUALIFICAÇÃO de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE: SILVIA CRISTINA DA SILVA PEDROSO
DATA: 31/07/2015
HORA: 09:30
LOCAL: Auditório do Instituto da Saúde e Produção Animal da UFRA
TÍTULO:

Diagnóstico histopatológico e imunohistoquímico e determinação molecular do Mycobacterium bovis de lesões sugestivas de tuberculose em bubalinos abatidos para consumo no Estado do Amapá

PALAVRAS-CHAVES:

Bubalino, Estado do Amapá, tuberculose, Mycobaterium bovis, Imunohistoquimica

PÁGINAS: 20
GRANDE ÁREA: Ciências Agrárias
ÁREA: Medicina Veterinária
SUBÁREA: Medicina Veterinária Preventiva
ESPECIALIDADE: Doenças Infecciosas de Animais
RESUMO:

A tuberculose é uma enfermidade infecto-contagiosa de distribuição mundial, causada em bovinos e bubalinos, predominantemente pelo Mycobacterium bovis. A doença tem caráter crônico debilitante com impacto econômico na produção de carne e leite em diversas regiões do mundo e o agente infeccioso é uma importante zoonose. O presente trabalho se propõe a estudar por métodos diretos o M. bovis em lesões sugestivas de tuberculose em carcaças de bubalinos abatidos para consumo no Amapá, com tipificação molecular dos agentes isolados. A coleta das amostras de estudo foi realizada no período de setembro de 2014 a abril de 2015, onde se obteve 107 casos de lesões sugestivas de tuberculose. A seleção de amostras será feita segundo estritas recomendações específicas de cada tipo de diagnóstico, e encaminhadas para o processamento laboratorial. Para a análise histopatológica, fragmentos com cerca de 0,5 cm de espessura serão coletados e fixadas em formol tamponado a 10% e processadas através das técnicas habituais para inclusão em parafina, corado pela hematoxilina e eosina. Para a analise imunohistoquimica os cortes em lâminas positivadas (ImmunoSlide-EasyPath) foi utilizando o método anti-peroxidase peroxidase, onde as secções foram incubadas com um anti-soro policlonal de coelho contra o M. bovis (Dako B0124; 1/4000) na diluição de 1:100, incubadas pelo complexo streptavidina-biotina (LSAB) com o anticorpo secundário biotinilado universal e para a revelação das reações foi utilizado o cromógeno diaminobenzidina (DAB). Para a extração do DNA micobacteriano amostras foram maceradas e adicionada de 100 ml de tampão de homogeneização (tris-HCL 1M, pH 8,0; NaCl 1M; EDTA 0,5M, pH 8,0; sacarose), 100 ml de tampão de lise (tris-HCL 1M, pH 9,0; EDTA 10mM, pH 8,0; sucrose 20%, SDS 10%) e 5 ml de proteinase K (10 mg/ml). Esta mistura foi incubada a 56°C por 12 horas. À temperatura ambiente, foram adicionados 200ml de fenol-clorofórmio-álcool isoamil (25:24:1), depois homogeneizados por 10 minutos e centrifugados a 13.000 rpm por 10 minutos. A extração foi repetida com 200 ml de clorofórmio-álcool isoamil (24:1). O sobrenadante foi transferido para outro tubo e adicionou-se 30 ml de acetato de sódio (3M, pH 4,8) e 150 ml de isopropanol, para precipitação do DNA. O DNA foi, então, lavado com 500 ml de etanol a 70%, seco a 37°C e ressuspenso em tampão EDTA. Na identificação molecular de Mycobacterium bovis as reações de PCR para cada sequência alvo (RvD1-Rv2031C) foram realizadas para um volume de 20 ml contendo 1 mM a 2,5 mM de MgCl₂,0,12 mM de cada desoxinucleotídeo, 10 pg de cada iniciador (JB21- TCG TCC GCT GAT GCA AGT GC, JB22- CGT CCG CTG ACC TCA AGA AG), glicerol 10%, tampão da Taq 1X, 0,5 U da enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen) e20 a 100 ng do DNA alvo. (Rodrigues et al, 1995). Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%, corados com sybersafe (Invitrogen) e visualizados em transiluminador de luz ultravioleta.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 220.629.201-72 - WASHINGTON LUIZ ASSUNÇÃO PEREIRA - UFRA
Interno - 016.410.772-04 - JOSE DE ARIMATEA FREITAS - NENHUMA
Externo ao Programa - 1661360 - CARINA MARTINS DE MORAES
Externo ao Programa - 1295787 - PEDRO SOARES BEZERRA JUNIOR
Externo à Instituição - ALEXANDRE DO ROSARIO CASSEB